Extraction des proteines

Extraction des proteines

Si la protéine existe dans un milieu biologique  liquide  ( plasma ,lait...)

aucune méthode d'extraction n'est nécessaire,

mais s'il existe dans un tissu ou cellule il y'a 3 méthodes possible.

voici la première:

 1. la lyse cellulaire:

    c'est la dégradation des cellules due a la rupture de la membrane plasmique aprés 

    une contrainte mécanique ( appareil e Potter)

- on choisie un matériel tissulaire que l'on sait riche en protéine .  

- on le broie grace à l'appareil de Potter.

                                                                                

- par un choc osmotique on achève l'éclatement cellulaire, ce qui va lyser la membrane de la cellule .

- on travaille dans un milieu tamponné et  à ( 0 °C) , pour n'est pas dénaturé les protéines .

==> on obtient enfin un homogénat cellulaire.

- on applique une centrifugation pour obtenir deux phase

                            - en bas : un débris cellulaire à éliminer

                            - en haut : phase liquide contenant les protéines 

  

- On récupère la phase liquide et on facilite la solubilisation des protéines dans des 

solutions salines (à forte concentration) et on  obtient alors un extrait brut .  

      ==> Ici on peut passer pour la séparation,

mais maintenant   la deuxième méthode pour l'extraction:           

 2.  A partir d'un type cellulaire isolé à partir d'un tissu:

cette méthode consiste a marqué des cellules contenant la protéine recherché 

et la sélectionné par un appareil trieur des cellules appelé  : cytofluorométrie .

Pou cela l'appareil utilise  des anticorps (AC) spécifique  pour la proteine recherché et  la marque par un fluorochrome  auquel ils sont couplé .

Ensuite l'appareil sélectionne les cellules fluorescentes.

ensuite dénombrement et caractérisation de notre proteine

 3.  A partir d'un organite particulier:

on effectue alors un fractionnement cellulaire,

c'est-a-dire qu'on sépare les différents constituants de la cellule grâce à l'ultracentrifugation =sédimentation accélérée.

. L'accélération (= la pesanteur) est remplacée par une accélération centrifuge (γ) qui est développée par un rotor tournant à grande vitesse

angulaire (ω). 

On obtient alors une force centrifuge (F).

La tendance d'une particule à se déplacée dans une solution sous l'effet de la force

centrifuge est donnée par un coefficient de sédimentation (s). Les molécules sphériques et de petites tailles ont un faibles coefficient de sédimentation.

=> centrifugation différentielle = succession d'ultracentrifugations pour lesquelles on fait varier la durée et la vitesse de rotation.

c'est-à-dire que les molécules de grandes taille se précipite le premier et celle